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研究背景
尽管在手术、放疗和分子靶向治疗方面取得了进展，非小细胞肺癌的死亡率仍然很高。针对程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)轴的ICIs通过激活细胞毒性T细胞活性来促进肿瘤细胞的杀伤。虽然这些抑制剂已经被批准用于晚期NSCLC的治疗，但由于肿瘤微环境(TME)中存在多种免疫抑制屏障，大多数患者几乎没有临床获益。因此，迫切需要努力寻找能够克服这些屏障，提高ICIs疗效的免疫调节剂。RT具有潜在的免疫调节特性，因为它可以触发免疫原性细胞死亡和激活抗原提呈细胞，使肿瘤特异性T细胞交叉激活，不仅可以限制原发肿瘤的生长，还可以产生针对远处(非内窥镜)转移灶的全身性效应。不幸的是，最佳的RT剂量和潜在的分子机制取决于癌症的类型，对于非小细胞肺癌，包括诱导最佳免疫调节的测序和剂量/分割方案，目前还知之甚少。新出现的证据支持ICIs和RT联合治疗包括NSCLC在内的各种肿瘤类型的可能性。一项I期试验显示，以前接受过放射治疗的NSCLC患者在接受ICIs治疗的情况下比没有接受过RT治疗的患者有更长的无进展生存期。然而，由于之前的试验缺乏确定的分子机制，目前的临床试验测试这种组合是由经验选择指导的，而这些选择可能并不是最优的。在这里，我们提供了机械性的见解，可能会加速非小细胞肺癌RT和ICIs联合治疗的发展。
?技术路线?
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?研究结果?
特定剂量的RT可增强PD-1阻滞剂的疗效
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在正在进行的人类和鼠肿瘤的研究中，已经报道了不同剂量的低分割RT，并提出了剂量和分割的关键重要性。因此，我们首先优化了微计算机断层扫描(μCT)引导下的HKP1荷瘤肺RT方案，该方案可以提高PD-1抑制的治疗效果。我们测试了一种先前报道在乳腺癌模型中具有免疫调节活性的RT方案：8Gy连续3天(8Gyx3)，以及两种较低剂量的方案，4Gyx3和0.5Gyx3(图1a)。值得注意的是，4Gyx3(4Gy-RT)联合PD-1抗体可显著控制肿瘤(图1b，c)并提高存活率(图1d)。此外，40%的小鼠无瘤存活，而仅接受PD-1抗体治疗的队列小鼠的无瘤存活率为10%。与单独抑制PD-1相比，0.5Gyx3和8Gyx3的其他剂量联合PD-1抑制并不能显著控制肿瘤或提高生存率(图1e，f)。
通过联合治疗获得持久的T细胞活性
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为了阐明不同放疗剂量的不同影响，我们在最后一次放疗后1d(放疗开始后第4天)检测了T细胞浸润和细胞因子的产生。在所有被检查的队列中，4Gy-RT显示在肿瘤胰岛浸润的CD8+T细胞数量最多(图2a和扩展数据图1a)，在HKP1肺中干扰素-γ+/肿瘤坏死因子-a+/CD4+T细胞和GzmB+/CD8+T细胞数量最多(图2b，c和扩展数据图1b)。这些4Gy-RT诱导的T细胞活性与其抑制PD-1的协同作用是一致的。越来越多的T细胞被招募到HKP1肺部，逐渐获得功能障碍的表型，表现为CD4+T细胞的效应细胞因子表达减少，如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-a(扩展数据图2a，b)。为了确定4Gy-RT是否增强了原有T细胞的功能，我们用S1P受体抑制剂FTY720治疗HKP1小鼠，FTY720可以阻止活化的T细胞从淋巴结流出(扩展数据图2c)。正如预期的那样，FTY720治疗通过减少循环T细胞(扩展数据图2d)，将4Gy-RT的效果局限于肺部原有的T细胞。与对照组相比，FTY720取消了4Gy-RT增加干扰素-γ+/肿瘤坏死因子-a+/CD4+T细胞和GzmB+/CD8+T细胞的能力(扩展数据图2e)。因此，在FTY720处理的小鼠中，4Gy-RT和抗PD-1联合治疗的效果被取消(扩展数据图2f)。这些发现表明，4Gy-RT并不能重新激活TME中原有的功能紊乱的T细胞。
4Gy-RT治疗可激活TME中的肺驻留棒状细胞
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为了探索4Gy-RT诱导抗肿瘤免疫反应的机制，我们检测了RT诱导的树突状细胞(DC)的激活。4Gy-RT治疗既没有引起肿瘤细胞死亡(扩展数据图4a)，也没有增加支气管淋巴结中CD103+交叉呈递的DC(扩展数据图4b)。接下来，我们对接受RT(0Gy、4Gy或8Gyx3)联合IgG或PD-1抗体治疗的HKP1肺进行RNA-SEQ分析。比较4Gy-RT组、0Gy(模拟)组和8Gy-RT(无效剂量)组在抗PD-1治疗前后的差异表达基因(P<0.01，倍增≥2和最小二乘平均≥5)。通过将IgG队列中4Gy-RT上调的基因与抗PD-1队列重叠，我们识别了144个特定于该有效辐射剂量上调的基因(图3a和扩展数据图5a)。为了确定这4个Gy-RT特征基因的细胞来源，我们对接受0Gy或4Gy-RT的HKP1荷瘤肺进行了单细胞RNA-seq(scRNA-seq)分析。通过将144个签名基因投影到t分布随机邻居嵌入(t-SNE)图，我们发现这些基因在4Gy-RT后在气道上皮/棒状细胞簇中显著上调(图3b)。
棒状细胞分泌体与联合治疗的疗效有关
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无论采用哪种耗竭方法，携带HKP1的肺对4Gy-RT的免疫反应均明显减弱，表现为T细胞向肿瘤胰岛的浸润显著减弱，效应细胞因子的产生减少(CD4+T细胞中的干扰素-γ/肿瘤坏死因子-a和CD8+T细胞中的GzmB)(图4C和扩展数据图6d)。值得注意的是，在HKP1荷瘤小鼠中，棒状细胞缺陷取消了联合治疗的疗效(图4d)。
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电子显微镜对棒状细胞的进一步表征显示，与对照组相比，从4Gy-RT治疗的肺中分离出的棒状细胞中分泌囊泡的数量增加(扩展数据图8a，b)。我们推测放疗后棒状细胞的分泌可能在提高ICIs疗效中起作用。为了解决这个问题，我们使用Scgb1a1-CreERTM/Snap23Flox/Flox转基因小鼠(简称Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)阻止棒状细胞分泌蛋白进入肺TME。突触体相关蛋白23(SNAP23)是SNARE复合体的关键成分，它介导细胞内囊泡融合到膜上，调节胞吐。他莫昔芬治疗Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠允许有条件的棒状细胞特异性缺失Snap23基因(图5a)，而不改变细支气管的完整性(扩展数据图8c)。对支气管肺泡灌洗液(BALF)的分析证实，与野生型对照相比，4Gy-RT治疗的Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠的棒状细胞分泌组成分CC10显著减少(图5b)。与棒状细胞消融一致，SNAP23缺乏抑制了HKP1肺对4Gy-RT反应中T细胞的浸润和激活(图5c和扩展数据图8d)。
棒状细胞减少促肿瘤炎症
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球状细胞缺陷(DT治疗)小鼠的肺显示髓系/淋巴细胞比率增加(Mye/LYM，对照组和DT治疗小鼠分别为0.96和1.34，图6a)。此外，杆状细胞缺陷肺中的髓样细胞表现出炎症介质的表达增加，如IL1b、PTGS2和TNF(图6b)，据报道它们可以抑制适应性抗肿瘤免疫。我们推测这些棒状细胞介导的TME改变可能影响了T细胞效应器的表型。使用基于图形的分类，T细胞被分成9个簇(图6c)，每个簇的功能状态根据它们的特征基因来确定(图6c和补充表2)。我们观察到效应T细胞簇(C5)显示细胞因子、效应分子(干扰素-γ和肿瘤坏死因子)和T细胞活化标志物(PDCD1和)表达增加，增殖T细胞簇(C9)显示颗粒酶和Ki67表达，调节性T细胞簇(C8)显示Foxp3和IL2ra表达(图6c)。值得注意的是，与对照组(分别为2.63和1.96)相比，去杆状细胞(DT治疗)降低了效应器、增殖T细胞和Treg细胞的比率((C5+C9)/C8)。总之，这些scRNA-seq结果表明，RT激活的棒状细胞的存在有助于适应性抗肿瘤免疫，可能是通过限制HKP1肿瘤中髓系细胞介导的炎症。BALF样本的ELISA检测显示，与0Gy对照组相比，4Gy-RT显著降低了HKP1TME中IL-1β、PGE_2和TNF-a的水平(图6d)，但在没有棒状细胞(DT处理的Scgb1a1cre/iDTR)或其分泌体(Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)的情况下，4Gy-RT未能减少这些炎症因子(图6d)。为了证明RT诱导的棒状细胞分泌体的临床相关性，我们在II期新辅助临床试验(NCT02904954)54中评估了接受RT联合ICIs(抗PD-L1)治疗的NSCLC患者的血浆水平。分别于首次立体定向全身放射治疗(SBRT)前1d和末次SBRT后1d采集血浆。匹配患者的CC10血浆浓度比较(放疗前和放疗后)显示，大多数获得病理改善的患者在放疗后血浆CC10水平升高(8人中有5人)，而无反应的患者(9人中有0人，P=0.0301)(图6e)，表明棒状细胞激活与联合治疗的病理反应有关。综上所述，这些发现表明，RT激活的棒状细胞通过其分泌体抑制了HKP1肺中的肿瘤前炎症，从而增强了适应性抗肿瘤免疫。
棒状细胞因子改善PD-1受体阻滞剂的疗效
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这些体外研究结果促使我们研究棒状鸡尾酒是否能反映4Gy-RT在改善体内PD-1阻断方面的效果。我们每天给HKP1小鼠鼻内注射棒状鸡尾酒(每只小鼠每只蛋白20ng)，连续3d(第11-13天)，并联合PD-1抗体(图8a)。值得注意的是，与模拟对照相比，联合PD-1抗体的棒状鸡尾酒治疗可显著控制肿瘤并提高HKP1小鼠的存活率(图8b，c)。与4Gy-RT相似，支气管肺泡灌洗液分析显示，与对照组相比，棒状鸡尾酒治疗组小鼠的肿瘤坏死因子-a、前列腺素E_2和IL-1β水平较低(图8d)。最后，为了确定棒状鸡尾酒和PD-1抗体联合治疗是否能产生持久的抗肿瘤免疫，我们进行了肿瘤再攻击实验。事实上，与对照组相比，存活的小鼠在3-5天内清除了肺部的肿瘤细胞(扩展数据图10e)。总之，这些发现表明，棒状细胞分泌蛋白通过抑制免疫抑制的MDSCs和增强T细胞功能来提高PD-1阻断的疗效。
?研究小结?
在NSCLC模型中，确定了一种特定剂量的RT，当与ICIs联合使用时，该剂量可使肿瘤消退并提高存活率。
RT的免疫调节作用归因于激活的肺居留Scgb1a1+棒状细胞。值得注意的是，具有棒状细胞特异性突触体相关蛋白23基因敲除的小鼠未能从联合治疗中受益，这表明棒状细胞分泌体起着关键作用。
我们鉴定了八种棒状细胞分泌蛋白，它们可以抑制免疫抑制的髓样细胞，减少肿瘤前炎症，增强抗肿瘤免疫。值得注意的是，联合治疗后NSCLC患者血浆中棒状细胞分泌组成员CC10水平升高。
?讨论?
我们的观察结果与主流观点一致，即RT联合ICIs可引起抗肿瘤反应。值得注意的是，我们的研究提供了一种机制，通过辐射诱导驻肺的Scgb1a1+棒状细胞分泌增强ICIs对非小细胞肺癌的治疗效果。越来越多的证据表明，与促癌炎症相关的免疫抑制微环境构成了癌症免疫治疗成功的主要障碍，并提出了以炎症为靶点来提高ICIs疗效的建议。与已报道的棒状细胞在过敏、哮喘和COPD中的抗炎作用一致，我们展示了RT激活的棒状细胞分泌蛋白在非小细胞肺癌中的耐人寻味的作用，它可以对抗多种免疫抑制介质，增强适应性抗肿瘤免疫。从我们的研究中得到的见解在临床翻译中具有显著的潜力。目前，由于特定物种的辐射敏感性和靶区体积的差异，目前缺乏将放射剂量从动物模型转换到人类以及反之亦然的标准。然而，我们的研究表明，未来的人类非小细胞肺癌临床试验应该考虑优化一种能有效介导肺部常驻棒状细胞激活的放射治疗剂量。目前，缺乏在不损害肺上皮完整性的情况下激活棒状细胞的药理学或遗传学方法。证明给予棒状细胞鸡尾酒增强了ICIs的疗效，在开发这些因素作为非小细胞肺癌的治疗方式方面具有巨大的潜力。进一步的研究需要确定能够产生强有力的治疗效果的分泌因子的最佳组成。值得注意的是，SBRT提高了对新辅助SBRT+ICIs治疗有反应的NSCLC患者的CC10水平，这一发现表明，RT诱导的血浆中的棒状细胞分泌因子可能有可能作为对SBRT/ICIs治疗有反应/无反应的非侵入性生物标志物。总之，来自我们研究的见解有可能为未来的临床试验提供指导，使放射和免疫治疗组合的有效性最大化，以提高病理应答率和改善非小细胞肺癌患者的存活率。